Неинвазивная светочувствительная рекомбиназа для глубокой генетической манипуляции в мозге

By Валерия Мешкова No comments

Неинвазивная светочувствительная рекомбиназа для глубокой мозговой генетической манипуляции
                Предоставлено: Корейский институт науки и технологий (KAIST).

Команда KAIST представила неинвазивную светочувствительную фотоактивируемую рекомбиназу, подходящую для генетических манипуляций in vivo. Очень светочувствительное свойство фотоактивируемой Flp рекомбиназы будет идеальным для управления генетическими манипуляциями в глубоких областях мозга мыши при освещении неинвазивным светодиодом. Этот простой в использовании оптогенетический модуль, созданный профессором Вон До Хео и его командой, обеспечит свободный от побочных эффектов и расширяемый инструмент генетических манипуляций для исследований в области нейробиологии.
                                                                                       

Пространственно-временной контроль экспрессии генов был признан ценной стратегией для определения функций генов со сложными нервными цепями. Исследования сложных функций головного мозга требуют очень сложных и надежных технологий, которые обеспечивают специфическую маркировку и быструю генетическую модификацию у живых животных. Был разработан ряд подходов для контроля активности белков или экспрессии генов пространственно-временным образом с использованием света, небольших молекул, гормонов и пептидов для манипулирования интактными цепями или функциями.

Среди них химически индуцируемые системы, использующие рекомбинацию, являются наиболее часто используемыми в системах модификации генов in vivo. Другие подходы включают селективные или условные Cre-активационные системы в подгруппах клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, или популяции клеток, управляемые двойным промотором.

Однако эти методы ограничены из-за значительного времени и усилий, необходимых для установления «зацепленных» линий мыши, и из-за ограничений пространственно-временного контроля, который опирается на ограниченный набор доступных генетических промоторов и ресурсов трансгенных мышей.

Помимо этих ограничений, оптогенетические подходы позволяют контролировать активность генетически определенных нейронов в мозге мыши с высоким пространственно-временным разрешением. Тем не менее, оптогенетический модуль для генной манипуляции, способный выявить пространственно-временные функции специфических генов-мишеней в мозге мыши, остается проблемой.

В исследовании, опубликованном на Nature Communications 18 января, команда представила фотоактивируемую рекомбиназу Flp путем поиска расщепленных сайтов рекомбиназы Flp, которые ранее не были идентифицированы, и способных к восстановлению, чтобы быть активными. Команда подтвердила высокую светочувствительность и эффективность фотоактивируемой рекомбиназы Flp благодаря точному нацеливанию на свет, демонстрируя экспрессию трансгена в анатомически ограниченных областях мозга мыши.

Представленная здесь концепция локальной генетической маркировки предлагает новый подход для генетической идентификации субпопуляций клеток, определяемых пространственными и временными характеристиками доставки света. До настоящего времени, оптогенетический модуль для манипулирования генами, способный выявлять пространственно-временные функции специфических генов-мишеней в мозге мыши, остался вне досягаемости, и такая система, индуцируемая светом, не была разработана. Соответственно, команда стремилась разработать фотоактивируемую рекомбиназу Flp, которая в полной мере использует высокий пространственно-временной контроль, предлагаемый световой стимуляцией.

Эта активация посредством неинвазивного светового освещения в глубине мозга является выгодной в том смысле, что она позволяет избежать побочных эффектов, связанных с имплантацией химических или оптических волокон, таких как нецелевая цитотоксичность или физические повреждения, которые могут влиять на физиологию или поведение животных. Этот метод обеспечивает расширяемые возможности для систем экспрессии трансгенов при активности рекомбиназы Flp in vivo путем конструирования вирусного вектора для минимальной экспрессии с утечкой, на которую влияют возникающие вирусные промоторы.

Команда продемонстрировала полезность PA-Flp как неинвазивного инструмента оптогенетических манипуляций in vivo для использования в мозге мыши, даже применимого для глубоких структур мозга, так как он может достигать гиппокампа или медиальной перегородки с помощью внешнего светодиодного освещения.

Исследование является результатом пятилетних исследований профессора Хео, который руководил областями биоизображения и оптогенетики, разрабатывая собственные технологии биоизображения и оптогенетики. «Это будет большим преимуществом контролировать специфическую экспрессию генов, необходимую для светодиодов, с небольшой физической и химической стимуляцией, которая может влиять на физиологическое явление у живых животных», — пояснил он.

Добавить комментарий